Парвовирус В19: взаимосвязь с внутриутробной гибелью плода в третьем триместре беременности

Скюлдербранд–Спарр Л., Толфвенстам Т., Пападоджиннакис Н., Варен Б., Бролиден К., Ньюман М. Введение Парвовирус В19 - типичная вирусная инфекция, распространяющаяся в сыворотке 50-70% взрослого населения. Вирус непосредственно связан со своим клеточным рецептором, Р-антигеном, и имеет тропность к незрелым эритроцитам в костном мозге или в зародыше. Инфекция приводит к подавлению образования эритроцитов, в результате чего развивается анемия. Заражению могут быть подвержены и другие ткани, такие как миокард и эндотелиальные клетки. К клиническим симптомам обычно относят повышение температуры и сыпь (инфекционная эритемия, венерическое заболевание), боль в суставах, слабо выраженные симптомы лихорадки или легкого недомогания. Инфекционное заражение может также протекать и без проявления каких-либо симптомов. Известно, что у беременных женщин вирус напрямую связан с анемией плода, анасаркой, выкидышем и внутриутробной гибелью плода. Существуют данные о некоторых случаях внутриутробной гибели плода во втором или третьем триместре, а также водянкой плода, вызванными целой совокупностью инфекций. Парвовирус В19 также относится к существенным причинам выкидышей на третьем триместре беременности. Однако в случаях выкидыша в третьем триместре, обусловленного водянкой плода, парвовирус В19 не являлся главной причиной. В перспективном исследовании активности антител к В19, проводимом среди беременных женщин, одна из пациенток, у которой отсутствовали антитела против В19, родила живого ребенка на 37-й неделе беременности. У плода не отмечалось каких-либо водяночных изменений, однако ДНК В19 была обнаружена в плацентарных тканях и в образцах материнской крови, взятых во время родов за три недели до гибели плода. Позже в крови у матери выработались антитела против В19, однако это произошло лишь шесть месяцев спустя после родов. Поскольку никаких других причин внутриутробной гибели плода обнаружено не было, вероятным становится тот факт, что В19 спровоцировал смерть ребенка ввиду медленного развития иммунологической защиты против инфекции у матери. Этот случай и явился толчком для проведения данного исследования. Методы Шведское законодательство определяет выкидыш, как гибель плода, вплоть до 28 недель беременности. В госпитале Дандерид (Danderyd Hospital) все случаи внутриутробной гибели плода исследуются согласно стандартному протоколу после полученного на это разрешения. Внутриутробная гибель плода определяется как смерть плода после 28 недели беременности. В протокол включаются исследования образцов материнской крови на наличие у плода сформировавшихся и содержащих ядра клеток красных кровяных телец, наличие антител иммуноглобулина класса IgG и IgM против токсоплазмы, краснухи, цитомегаловируса, вируса простого герпеса, парвовируса В19 и листериоза, гормонов щитовидной железы и антител гормонов щитовидной железы. Берется бактериальный посев из шейки матки. В большинстве случаев проводится амниоцентез для хромосомного исследования, а также околоплодных вод с целью высева бактериальных и вирусных культур (однако парвовирус В19 не может быть определен при стандартном исследовании вирусных культур). После рождения проводится исследование образцов крови плода. Плацента проходит гистологическое исследование и в случае необходимости подвергается микробиологическому анализу. Рекомендуется проводить вскрытие плода, однако не все родители согласны пойти на этот шаг. Начиная с 1992 года, у всех пациенток, принимаемых в госпиталь Дандерид с диагнозом внутриутробной гибели плода, проводился анализ материнской сыворотки на наличие антител к В19 класса IgG и IgM, а также на наличие ДНК В19 при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) в образцах плацентарных тканей. На протяжении семи лет исследований, с 1992 по 1998 год, было зарегистрировано 93 случая внутриутробной гибели плода. В общей сложности за этот период было принято 33 759 родов. В данном исследовании представлены случаи внутриутробной гибели плода, вызванной В19, которые произошли в декабре 1991 года (начальная точка отсчета), апреле 1993, мае 1993, январе 1994, ноябре 1994, мае 1997 и октябре 1998 года (случаи с первого по седьмой соответственно). Внутриутробная гибель плода была диагностирована при помощи ультразвукового исследования, и роды были приняты в течение 36 часов. Для проведения сравнительного анализа в период с июня 1997 по декабрь 1998 года были собраны образцы плацентарных тканей после выкидышей в первом триместре беременности у 50 случайно отобранных пациенток. Эти образцы были исследованы идентично образцам тканей пациенток с внутриутробной гибелью плода. Образцы плацентарных тканей и материнской сыворотки были собраны сразу после родов и помещены на хранение на 24 часа при температуре -20°С. Сразу после родов были также взяты дополнительные образцы плацентарных тканей, которые были обработаны формальдегидом и помещены в парафин. После полученного со стороны родителей согласия было произведено вскрытие плода (случаи 1, 2, 5 и 6), после чего была проведена стандартная биопсия тканей. Как одна из сторон диагностического исследования, вскоре после родов был проведено серологическое исследование. На протяжении длительного периода исследования проводились различные анализы для определения В19 IgG и IgM. Для получения сравнительных данных, полученных в разные годы, все образцы были перепроверены при помощи единого диагностического набора (иммунофлуоресцентный анализ Биотрин В19 IgG и В19 IgM, Biotrin Inc., Dublin, Ireland). Перед проведением ПЦР замороженные ткани были разморожены и гомогенизированы в стерильных ступках, после чего прошли температурную обработку (95 градусов в течение 10 минут) и центрифугу (14 000 оборотов в минуту в течение 10 минут). Образцы сыворотки были исследованы таким же образом. Полученная надосадочная жидкость (2 микролита) была взята в качестве образцов для проведения полимеразной цепной реакции. Парафиновые блоки нагревались отдельно в стерильных камерах при температуре 65 градусов с тем, чтобы расплавить парафин. После этого при помощи стерильных скальпелей и пинцетов были отделены небольшие кусочки тканей весом 25 мг. С каждого кусочка был смыт парафин при помощи ксилола и стопроцентного этанола. После испарения этанола при помощи набора Qiagen Tissue Kit (Германия) была вычленена ДНК. Операция проводилась в соответствии с инструкцией производителя, за исключением последнего вымывания в 100 микролитах воды с целью достижения концентрации ДНК. Полученная суспензия (2 микролита) была использована в качестве образца для проведения ПЦР. Оставшиеся образцы тканей были снова помещены в парафин для последующего проведения иммуногистохимии. В каждом образце контролировалась ДНК на содержание или отсутствие В19 (образцы тканей или сыворотки). Значительные кусочки различных частей каждой плаценты, как и ткани самого плода, были закреплены формалином и помещены в парафин в соответствии со стандартными правилами. Отдельные кусочки были окрашены при помощи гематоксилина и эозина для определения наличия вирусных инфекций в проэритроцитах. Иммуногистохимический анализ для определения наличия В 19 был также проведен в закрепленных формалином и помещенных в парафин тканях. В системе автоматического окрашивания (TechMate, DakoPatts, США), основанной на технологии использования стрептавидинбиотина, были задействованы два моноклональных антитела анти-В19. Результаты В течение семилетнего периода исследований внутриутробная гибель плода была диагностирована у 93 из 33.759 женщин (0,3%). Среди 93 пациенток у 7 (7,5%) в плацентарных тканях была обнаружена ДНК В19. В ходе стандартного исследования никаких других причин гибели плода во всех 7 случаях обнаружено не было. Таким образом, парвовирус В19 был признан в качестве возможной этиологии. Количество обнаруженных В19-позитивных ДНК было слишком незначительным, чтобы связывать его с сезонным или годовым видом эпидемии В19 в обществе. Подобные эпидемии были зарегистрированы клиническими вирусологическими лабораториями в начале лета 1994 и в 1998 году соответственно (данные не приведены). На протяжении беременности ни у одной из 7 женщин не наблюдались сыпь, боли в суставах или другие клинические симптомы парвовирусной инфекции. Нет никаких данных и о контактах с зараженными парвовирусной инфекцией людьми. Помимо ПЦР В19 на свежезамороженных тканях при рождении, описанными выше методами ретроспективно исследовались плацентарные ткани плода, помещенные в парафин (табл. 1). ДНК В19 была обнаружена в плацентарных тканях в 6 из 7 случаев внутриутробной гибели плода. В дополнение ДНК В19 была обнаружена в тканях печени и почек. ДНК В19 была протестирована при помощи ПЦР лишь в некоторых образцах материнской сыворотки. Случай № 1 показал положительный результат за месяц до родов и во время них. В случае № 6 результат был отрицательный 21 месяц спустя после родов, а в случае № 7 положительный результат дали три пробы, последовательно взятые пять месяцев до родов, во время родов и два месяца после них (данные не отображены). В качестве контрольных образцов были взяты образцы плаценты после выкидышей в первом триместре беременности. Эти образцы тканей хранились и были исследованы таким же способом, как и образцы тканей в случаях с внутриутробной гибелью плода, и один образец из пятидесяти показал наличие в нем ДНК В19. В19 IgG оказался отрицательным в 5 из 7 образцов материнской крови, забранной во время родов (случаи 1-5, табл. 1). В случае № 1 он появился между вторым и шестым месяцем после рождения. В случае № 5 В19 IgG оставался отрицательным даже 8 месяцев спустя. Образец крови случая № 6 был уже В19 IgG положительный, о чем свидетельствуют образцы крови, взятые за 25 месяцев до внутриутробной гибели плода и во время предыдущего выкидыша. Анализ авидности и специфической эпитопной реактивности, выполненный доктором Хедманом (Dr. Hedman) (Университет Хельсинки, Финляндия), исключил возможность недавнего (менее шести месяцев) первоначального инфицирования в тот момент (данные не приведены). В случае № 7 был В19 IgG и В19 IgM положительным 5 месяцев до внутриутробной гибели плода. Показатели В19 IgG повысились в течение этих пяти месяцев и затем снизились в течение двух последующих месяцев. Самый высокий уровень В19 IgM был обнаружен в первом образце, в последующем его уровень снизился, хотя его еще можно было определить два месяца спустя после родов. Подобная схема, как правило, прослеживается в случае недавнего первичного заражения. Ни в одном из семи случаев внутриутробной гибели плода не было водянки плода. Макроскопическое исследование плаценты показало лишь незначительные, локальные патологии, такие как мелкие межворсинчатые тромбозы. Случаев обширного инфаркта или кровотечений зафиксировано не было. Гистопатологическое исследование плаценты выявило незначительные отклонения, например, центральный ворсинчатый отек, небольшие межворсинчатые тромбозы или повышенное образование эритроцитов (табл. 1). Специальная В19-иммуногистохимия для определения вирусных протеинов дала отрицательный результат, ни в плацентарных тканях, ни в тканях плода вирусных примесей обнаружено не было (данные не приведены). Следует отметить, что некоторые из образцов тканей были сильно аутолизированы, что осложняло их оценку. Обсуждение По нашему мнению, это первое продолжительное перспективное исследование, описывающее частоту внутриутробной гибели плода в третьем триместре беременности, связанной с В19. Только 60-70% случаев внутриутробной гибели плода можно объяснить в свете стандартных процедур исследований. Эта частота сравнима с данными, предоставляемыми другими исследовательскими центрами. Начиная с 1992 года, нам удалось обнаружить 7 В19-позитивных плацентарных тканей среди 93 (7,5%) случаев внутриутробной гибели плода в третьем триместре беременности. ДНК В19 была проанализирована при помощи ПЦР на свежезамороженных плацентарных тканях, полученных вскоре после родов. К окончанию исследовательского периода мы изучили архивные материалы (